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Club Métalloprotéines et Modèles & Groupe thématique "Métalloprotéines" de la Société Française de Biochimie et Biologie Moléculaire Aussois 2006


Club Métalloprotéines et Modèles &
Groupe thématique "Métalloprotéines" de la Société Française de Biochimie et Biologie Moléculaire
Aussois 2006


Protéomique

Herman van Tilbeurgh

IBBMC, Equipe Génomique Structural, Bâtiment 430
Université de Paris-Sud, 91405 ORSAY Cedex

herman.van-tilbeurgh@ibbmc.u-psud.fr

Investigation of the radical intermediates formed in heme-catalases by multifrequency EPR and stopped-flow UV-visible spectroscopies .

Colina J., Switalab J., Una S., Loewenb P., Ivancicha A.

a) Service de Bioénergétique, URA 2096 CNRS, DBJC, CEA Saclay,
91191 Gif-sur-Yvette, France.
b) Department of Microbiology, University of Manitoba, Winnipeg, Canada

julie.colin@cea.fr


In heme catalases, the [Fe(IV)=O Por•+] (Compound I) reacts with H2O2. In certain catalases an [Fe(IV)=O Tyr] species is formed by intramolecular e- transfer between tyrosine and porphyrin at 0°C1, similar to the case of the bi-funtional peroxidases (KatGs), which present a catalytic activity comparable to the monofunctional catalases2. According to the available eleven 3D-crystal structures of catalases3, the heme microenvironment is highly conserved, thus the differences in specific activity (20,700 to 225,000 units/mg of protein4) remains unexplained. In order to possibly correlate the reactivity of compound I towards H2O2 and the alternative tyrosyl radical formed, we have characterised eight catalases by using Electronic Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy and stopped-flow absorption spectrometry. We have found that those catalases which form only the Compound I both at 0°C and 15°C have the highest specific activity. In addition the formation of a subsequent [Fe(IV)=O Tyr] intermediate, as a function of pH and/or temperature well agrees with the observed decrease of the specific activity.


1. Ivancich A., Jouve H. M., Sartor B., Gaillard J., Biochemistry, 1997, 36, 9356-9364.

2. Ivancich A., Jakopitsch C., Auer M., Un S., Obinger C. J. A. C. S., 2003, 125, 14093-14102.

3. Chelikani P., Fita I., Loewen P. C. Cellular and MolecularLife Science, 2004, 61, 192-208.

4. Switala J., Loewen P. C. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2002, 401, 145-154.

Probing the function of the cysteine axial ligand in Superoxide Reductase

Weill, C. O., Mathé, C., Mattioli, T. A., Berthomieu, C., Houée-Levin, C., and Nivière, V.

Laboratoire de Chimie et Biochimie des Centres Redox Biologiques, DRDC-CEA/CNRS/Université Joseph Fourier, 17 Avenue des Martyrs, 38054 Grenoble Cedex 9.

e-mail: vniviere@cea.fr


Superoxide reductase (SOR) catalyzes the one-electron reduction of O2•- to H2O2, providing an antioxidant defense in some anaerobic or microaerophilic bacteria:1,2

O2•- + 1e- + 2H+ → H2O2 (SOR)

The active site of SOR consists of a non-heme Fe2+ center in an unusual [His4 Cys] square pyramidal pentacoordination.1 The sixth coordination site of the Fe2+ center is vacant and suggests the most obvious site for O2•- binding.3, 4

The presence of a cysteine axial ligand in the SOR iron active site has been proposed to be an essential feature in the reactivity of the enzyme with superoxide. Similarly to that reported in cytochrome P450 enzymes, rubredoxins or ferredoxins, specific amino acid residues surrounding the cysteine ligand could finely tune the strength of the Fe-S bond.

In this work, we have investigated by site-directed mutagenesis, rapid kinetics, resonance Raman and FTIR spectroscopies in which extent the presence of some amino acid residues near by the cysteine ligand could modulate the reaction of the iron active site with superoxide.


1. Nivière, V., and Fontecave, M. J. Biol. Inorg. Chem., 2004, 9, 119-123.

2. Molina-Heredia, F. P., Houée-Levin, C., Berthomieu, C., Touati, D., Tremey, E., Favaudon, V., Adam, A., Nivière, V. PNAS, 2006, in press.

3. Mathé, C., Mattioli, T. A., Horner, O., Lombard, M., Latour, J. M., Fontecave, M., Nivière, V. J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, 4966-4967.

4. Nivière, V., Asso, M., Weill, C.O., Lombard, M., Guigliarelli, B., Favaudon, V., and Houée-Levin, C. Biochemistry, 2004, 43, 808-818.

Etudes par ATR-FTIR de la Horseradish peroxydase et de la Myoglobine

Christelle Mathé, Peter Rich and John Ingledew.

Université Paris XI
Equipe Chimie Inorganique, Institut de Chimie Moléculaire et des Matériaux d'Orsay
bât 420, 91405 Orsay Cedex.

mathe.c@wandoo.fr


Les changements vibrationnels au niveau des sites actifs de la Horseradish peroxydase et de la Myoglobine sont étudiés par spectroscopie ATR-FTIR (Attenuate Total Reflection Fourier Transform Infrared). Les spectres de différences sont générés électrochimiquement (réduits-minus-oxydés) ou par la méthode de dialyse de substrat. La spectroscopie ATR-FTIR permet l’obtention d’informations très fines sur la structure du site actif et notamment en mettant en évidence des changements vibrationnels aussi bien au niveau de l’environnement du site actif, de certains acides aminés particuliers ou de cofacteur. L’attribution de ces vibrations FTIR peut être effectuée grâce à la comparaison de structures cristallographiques déjà connues, par l’utilisation de models d’acides aminés et de cofacteur, ainsi que par des marquages isotopiques H2O/D2O et des changements de pH/pD dépendant/indépendant.

Les spectres de différences redox entre la Horseradish peroxidase1 et la Myoglobine2 indiquent des variations dans l’environnement de l’hème. Le spectre redox de la Horseradish peroxydase montre les contributions importantes de l’arginine 38 et des histidines 42/170, tandis que celui de la Myoglobine est fortement prédominé par le signal de l’histidine 93. Ceci indique une implication et des rôles différents de ces acides aminés dans l’activité de ces protéines. Par l’utilisation d’une nouvelle méthode de dialyse, nous avons pu faire réagir ces deux hémoprotéines avec H2O2 et l’acide péracétique afin de générer d’importants intermédiaires réactionnels tel que le complexe I (Horseradish peroxidase) et le complexe II [FeIV=O….H] (Myoglobine)3. Les spectres de différences FTIR nous permettent de mieux comprendre les interactions, les changements structuraux impliqués durant les réactions catalytiques qui permettent la formation de ces intermédiaires réactionnels.


1. W. J. Ingledew and P. Rich. Biochemical society Transactions, 2005, 33, part 4, 886.

2. Dalton, PNAS, 2005, 3483-3488.

3. Berglund and al. Nature, 2002, 417, p463.

Etude des vibrations métal-ligand dans le domaine IR lointain : hémoprotéines et modèles.

Marboutin, L.; et Berthomieu, C.

CEA-Cadarache
Laboratoire des Interactions Protéine-Métal
Bât 185, DSV/DEVM UMR 6191 F-13108 Saint Paul lez Durance cedex, France
laure.marboutin@cea.fr


La spectroscopie IR-TF (Infrarouge à transformée de Fourier) couplée à l'électrochimie est une technique particulièrement efficace pour mettre en évidence les modifications structurales provoquées par le changement de l'état d'oxydoréduction du métal lors de l'étude de métalloprotéines redox en solution. Les informations reflétant les interactions entre le métal et ses ligands sont particulièrement utiles à la compréhension des mécanismes réactionnels et sont situées dans la zone des basses fréquences IR. Jusqu'alors, aucune information n'existe sur les vibrations métal-ligands au sein de métalloprotéines redox en solution en IR, illustrant la difficulté d'adapter l'appareillage IR-TF à l'exploration d'un domaine de fréquence où les énergies mises en jeu sont faibles.

Dans un premier temps, nous avons développé une approche expérimentale permettant d'obtenir des spectres IR-TF de différence pour l'analyse de métalloprotéines redox dans les basses fréquences IR et montré son application à l'étude du cytochrome c.1

L'étude de la MP8, un modèle d'hémoprotéine, dans les fréquences IR classiques (1800-1000 cm-1) nous a permis de mettre en évidence les modes IR de l'hème sensibles à l'état redox et à l'état de spin du fer, ainsi que les modes IR caractéristiques des ligands axiaux et de leur état de protonation.2

Afin de mettre en évidence les modes de vibration fer-ligands, nous avons analysé ces complexes dans la zone des basses fréquences IR (1000-700 cm-1). L'étude des complexes penta- et hexacoordonnés de la MP8 et des complexes (Im)2-PPIX a permis de détecter les modes IR impliquant les vibrations Fe-ImH, Fe-Im- ainsi que les modes IR impliquant le fer et les pyrroles de l'hème.


1. Berthomieu, C.; Marboutin, L.; Dupeyrat, F.; Bouyer, P. Biopolymers, 2006, 82(4), 363-367.

2. Marboutin, L.; Boussac, A.; Berthomieu, C. J Biol Inorg Chem, 2006, 11(7), 811-823.

Etude structurale par RMN d'une métalloenzyme impliquée dans la biosynthèse de centre Fe-S: Suf A

Duraffourg, Na; Houben Kb ,Blanchard, Lb ; Marion, Db; Ollagnier-de-Choudens, Sa ; Fontecave, Ma

a Laboratoire de Chimie et Biochimie des centres Redox Biologiques, UMR 5047 CEA /CNRS/Université Joseph Fourier, 17 Avenue de Martyrs,
38054 Grenoble CEDEX 9, France
b Institut de Biologie Structurale 'Jean-Pierre Ebel', UMR 5075 CEA /CNRS/Université Joseph Fourier, 41 rue Jules Horowitz 38027 Grenoble CEDEX 1, France


Les centres Fe-S sont parmi les cofacteurs les plus importants d'un point de vue structural et fonctionnel en biologie [1]. Toutefois, la biogénèse de ces centres métalliques et leur mode d'incorporation dans les apoprotéines sont très mal connus. Dans les dernières années, deux systèmes multiprotéiques ont été découverts comme participant à la biosynthèse et à l'incorporation des centres Fe-S [2]. Un premier système, nommé ISC (Iron Sulfur Cluster) comprend 8 protéines dont les gènes sont organisés sous la forme d'un opéron et une seconde machinerie codée par l'opéron suf (mobilisation of SUlFur), sont étudiés au laboratoire. Il a été récemment découvert un troisième système, nommé CSD [3,4].

Le système SUF d'Escherichia coli est composé de six protéines: deux, SufS et SufE, forment un complexe qui présente une activité cystéine désulfurase SufB SufC SufD, quant à elles, forment une deuxième complexe présentant une activité ATPase. SufA, dite protéine "Scaffold", préassemble transitoirement les clusters afin de les transférer vers des apoprotéines cibles.

La détermination de la structure par RMN de SufA a nécessité l'enregistrement d'expériences de triple résonances pour l'attribution séquentielle des résidus, ainsi que la collecte de contraintes structurales de type nOe d'une part, à partir d'expériences 3D HSQC-NOESY édités 15N et 13C, et de constantes de couplages résiduels dipolaires (RDC) d'autre part[5]. La structure est calculée via le programme de dynamique moléculaire ARIA.

^ HF-EPR Characterization of Mn(II) Proteins and Related Complexes.

Hureau, C.;a Tabares, L.;a Lassalle, B.;b Guillot, R.;b Yano, J.;c and Un, S.a

a) CEA Saclay – Section de Bio-Energétique - 91191 Gif-Sur-Yvette, France 
b) Institut de Chimie Moléculaire et des Matériaux d’Orsay – 91405 Orsay, France 
c) Lawrence Berkeley National Laboratory, CA 94720, Berkeley, USA.

chrishureau@yahoo.fr


Mn(II) ions are involved in the catalytic cycle of various enzymes. In this context, HF-EPR (High-Field Electron Paramagnetic Spectroscopy) has been proved to be a powerful tool to determine the magnetic properties of Mn(II) containing proteins.[1,2] Objectives were to find a correlation between the magnetic parameters and the structure around the Mn center, and ultimately to obtain some insights into the catalytic pathway. To examine this issue, we use a series of Mn(II) complexes to study the relationship between the Zero-Field Interaction and the structure. Their HF-EPR signature were relevant to Mn(II) containing biological systems (Figure 1). Determination of the electronic parameters was achieved by direct measurements on the HF spectra and by simulations (Figure 1). We show that, within this family of complexes, the magnitude of the electronic interaction is highly influenced by the two angles  (Figure 2), and not by the Mn-N bond lengths, as evidenced by EXAFS.



Figure 1. Top : HF-EPR spectrum of the PgMn SuperOxyde Dismutase (190 GHz) and of one spectroscopic related complex (95 GHz).

Bottom : HF-EPR spectrum of the Mn containing Photosynthetic Reaction Center (190 GHz) and of one spectroscopic related complex (190 GHz).

Black line : experimental, Red line : simulation.

Figure 2. Schematic diagram of one of the Mn model complex, showing the two  angles.

1. Un, S.; Tabares, L.; Cortez, N.; Hiraoka, Y.; Yamakura, F.; J. Am. Chem. Soc., 2004, 126, 2720-2726.

2. Tabares, L.; Cortez, N.; Hiraoka, Y.; Yamakura, F.; Un, S.; Biochemistry, 2006, 45, 1919-1929.

Immobilisation de protéines hémiques sur électrodes
Etudes électrochimiques et caractérisations structurales


Balland Véronique#, Lecomte Sophie§, Limoges Benoit#

# Laboratoire d’Electrochimie Moléculaire, Université Paris VII UMR 7591, 2, place Jussieu, Case 7107, 75251 Paris Cedex 05
§ LADIR, Université Paris 6 UMR 7075, 2 rue H. Dunant, 94320 Thiais

veronique.balland@paris7.jussieu.fr

L’immobilisation de protéines redox sur des surfaces variées en conditions non dénaturantes est un enjeu majeur pour l’étude de ces protéines par électrochimie et pour leur utilisation dans les biotechnologies. Nous présentons ici un système d’immobilisation par affinité basé sur la technologie acide nitriloacétique (NTA) / His-tag, largement utilisée dans les biosciences pour la purification des protéines présentant un résidu His-tag en position C- ou N-terminale.

Diverses protéines hémiques his-taggées (Neuroglobine, Cytochrome b5, Nitric Oxide Synthase) ont ainsi été greffées à la surface d’électrodes : soit sur électrode nue, soit sur électrode modifiée par une monocouche de thiol-NTA (Figure 1). Ces électrodes ont ensuite été étudiées par Raman exalté de surface et voltamétrie cyclique. Les résultats obtenus montrent que le système thiol-NTA permet l’immobilisation spécifique de protéines His-taggées en maintenant leurs structures natives intègres et offre des conditions de transfert électronique direct entre électrode et centre redox.



Figure 1: Processus de modification d’une électrode en quatre étapes permettant l’immobilisation spécifique de protéines His-taggées

^ Transferts couplés e-/H+ d’intérêt biologique. Approche électrochimique.

Robert, M.; Costentin, C.; Savéant, J-M.

Université Paris 7 – Denis Diderot, Laboratoire Electrochimie Moléculaire
UMR CNRS 7591, Case 7107, 2 Place Jussieu, 75251 Paris Cedex 05

robert@paris7.jussieu.fr


Transfert d’électron et transfert de proton sont couramment associés dans de nombreuses réactions de la chimie du transfert d’électron et de la chimie radicalaire. Jusqu’à très récemment, ils étaient conçus comme se produisant de façon séquentielle. Cette conception doit se modifier au vue d’une série d’indices, récemment découverts, qui indiquent que ces deux réactions pourraient bien être concertés dans de nombreux processus naturels. Le plus en vue d’entre eux concerne le Photosystème II, mais il y a quelque indication qu’une telle concertation puisse aussi être à l’œuvre dans le fonctionnement de la cytochrome c oxidase, la ribonucleotide reductase, la prostaglandin H synthetase, la galactose oxidase et la superoxyde dismutase.

Il ne s’agit sans doute que de la pointe émergée de l’iceberg du fait que transfert (et/ou transport) d’électron et transfert (et/ou transport) de proton sont associés dans un nombre considérable de processus naturels. On peut même se demander si l’efficacité remarquable des systèmes enzymatiques dans lesquels transfert d’électron et transfert de proton sont associés ne serait tout simplement pas le résultat de leur concertation.

L’approche électrochimique de la concertation proton-électron, en combinant théorie et expérience, peut contribuer à la résolution des aspects fondamentaux du problème et à ses implications biologiques.1 Nous l’illustrerons en particulier avec l’étude de l’oxydation monoélectronique à une électrode d’un phénol couplée à un transfert de proton intramoléculaire vers une amine (schéma ci-contre).1b


1. (a) C. Costentin, M. Robert, J-M. Savéant, J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 8726-8727. (b) C. Costentin, M. Robert, J-M. Savéant, J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 4552-4553. (c) C. Costentin, D. H. Evans, M. Robert, J-M. Savéant, P. S. Singh, J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 12490-12491.

VERS DES SYSTEMES BIOMIMETIQUES DE LA PAIRE HISTIDINE 190-TYROSINE Z DU PHOTOSYSTEME II : Influence du pH.

Fabien Lachaud a, Annamaria Quaranta b, Marie-France Charlot a,
Winfried Leibl b , Ally Aukauloo a.

aLaboratoire de Chimie Inorganique, Bât.420, 91405 Orsay cedex.
b Service de Bioénergétique, CEA Saclay, Bât 532, 91191Gif –sur Yvette

flachaud@icmo.u-psud .fr


A
u sein des plantes, de certaines algues et bactéries, a lieu la photooxydation de l‘eau en dioxygène et protons. Le centre responsable de cette oxydation est le photosystème II, enchassé dans la membrane des thylacoïdes. Plusieurs cofacteurs sont essentiels au bon fonctionnement de ce système, notamment le P680, la paire Histidine 190-Tyrosine Z, et le cluster à base de Manganèse, Calcium, Chlorure[1]. Nous sommes, au sein du laboratoire, attachés à la modélisation du photosystème II dans son ensemble. La première étape de cette modélisation a été d’élaborer une molécule pouvant mimer le transfert électronique entre le P680 et la paire Histidine 190-Tyrosine Z . Le P680 sera modélisé par un analogue du Ru(bipy)3 connu pour ses propriétés photophysiques. Un ligand de type bipyridine modifiée permettra de mimer la paire Histidine 190- Tyrosine Z . Cette molécule cible représentée ci dessous :

a présenté un transfert photoinduit du ligand modèle vers le Ru III[4] . Des études en fonction du pH sont actuellement menées pour comprendre l’influence de celui-ci sur les transferts photo-induits.


1A. W. Rutherford, A. Boussac, Science 2004, 303, 1782-1783

2. B. Akermark et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 12, 6834

3. D. Burdinski. K. Wieghardt .S. Steenken. J. Am. Chem. Soc. 1999,121,10781-10787

4. F. Lachaud et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2005 , 44, 1536-1540


Réaction stoechiométrique de transfert d’amine effectuée

par un complexe dinucléaire à fer non héminique: étude mécanistique

Gouré, Ea; Avenier, Fa; Galtier, Ra; Dubourdeaux, Pa; Sénèque, Oa; Lebrun, Cc; Pécaut, Jc; Chardon-Noblat, Sb; Deronzier, Ab; Oddou, J.-La; Blondin,Ga; Latour, J.-Ma

aLaboratoire de Physico-chimie des Métaux en Biologie, UMR 5155 CEA –CNRS – UJF
DRDC, CEA-Grenoble, 38054 Grenoble Cedex 9 France
b Laboratoire d’Electrochimie Organique et Photochimie Redox, UMR 5616 UJF 301 rue de la Chimie - Batiment B - Domaine Universitaire F-38400 St Martin d’Hères - BP 53 - F-38041 Grenoble Cedex 9 France
c Laboratoire de Chimie Inorganique et Biologique, UMR E-3 CEA-UJF, DRFMC, CEA-Grenoble, 38054 Grenoble Cedex 9 France

eric.goure@cea.fr


Lorsque le complexe [FeII,III2(LBn)(mpdp)]2+ possédant un groupe benzyle libre sur le ligand (Schéma) est traité par un donneur d’amine (tosyliminoaryliodinane, ArI=NTs), on observe l’insertion d’un ou deux groupes tosylamine sur les positions ortho du groupe benzyle. Le produit monosubstitué résultant a été caractérisé par plusieurs méthodes (ESI-MS, cristallographie, RMN, spectroscopie Mössbauer, susceptibilité magnétique et électrochimie). Tout indique que le composé est un complexe diferrique [FeIII,III2(LBn-H+NTs)(mpdp)]2+ avec un groupe ortho-anilinate terminal lié à un des ions fer (Schéma).


L’étude du mécanisme d’insertion d’amine par diverses méthodes (UV-visible, RPE, Mössbauer, ESI-MS, électrochimie) révèle deux chemins réactionnels parallèles qui seront détaillés.


* Avenier F.; Latour J.-M., ^ Chem. Commun. 2004, 1544-1545.

Glycoligands et Glycocomplexes : Exploration des propriétés d'une nouvelle famille de ligands. Implications en chimie inorganique et bioinorganique

Federico Cisnetti(1),
Régis Guillot(1), Magali Nicaise(2), Michel Desmadril(2), Michel Thérisod(1), Clotilde Policar(1)

Université Paris-Sud XI
(1) ICMMO (UMR 8182), Équipe de Chimie Bioorganique et Bioinorganique
(2) Institut de Biologie et Biophysique Moléculaire et Cellulaire (UMR 8619)
91405 Orsay CEDEX, France

cisnetti@icmo.u-psud.fr


Les glycoligands sont une nouvelle famille de ligands construits par fonctionnalisation par des bases de Lewis de certaines fonctions hydroxyle des monosaccharides. Si le sucre est choisi judicieusement (stéréochimie, conformation) une cavité chélatante est générée. Cette idée est nouvelle dans le champ de la chimie de coordination et s'inspire de travaux réalisés dans le domaine de la chimie peptidomimétique[1]. La richesse synthétique de la glycochimie est mise à profit pour la synthêse de « châssis » variés.

De nombreux nouveaux glycocomplexes de métaux divalents (Mn , Fe, Co, Ni, Cu, Zn) ont été isolés sous forme cristalline et caractérisés par diffraction des rayons X[2]. Les complexes ainsi isolés sont bien évidemment des objets chiraux, non seulement au niveau du sucre, mais également au niveau de la première sphère de coordination du cation métallique. Des spectres de dichroïsme circulaire (bandes d-d) ont été mesurés en phase solide et en solution pour une série de glycocomplexes de Co(II), montrant que la structure chirale est maintenue en solution. Une corrélation entre le signal dichroïque et certains paramètres structuraux des complexes a été mise en évidence. Par ailleurs, les constantes d'association d'une série de complexes ont été mesurées par microcalorimétrie, mettant en évidence une influence favorable de la présence d'une structure cyclique dérivée de sucres, si elle se trouve dans une conformation favorable, sur l'interaction ligand-cation métallique.

La préformation et la chiralité des sites chélatants sont des caractéristiques d'intérêt en chimie bioinorganique. Les résultats que nous avons obtenus nous encouragent dans nos efforts vers la synthèse de complexes antioxydants bioinspirés obtenus à partir de glycoligands.





1. S.A.W. Gruner, E.Locardi, E.Lohof, H.Kessler, Chem. Rev., 2002, 102, 491-514.

2. F. Bellot, R. Hardré, M. Thérisod, C. Policar, Chem. Commun., 2005, 5414-16

Modèle supramoléculaire polytopique de site actif de métallo-enzymes : modularité et sélectivité topologique

David Coquiere, Olivia Reinaud.

Université René Descartes, Laboratoire de Chimie et Biochimie Pharmacologiques et Toxicologiques, UMR CNRS 8601, 45 rue des Saints-Pères, 75270 Paris cedex 6, France

Olivia.Reinaud@univ-paris5.fr


Les ligands tris-imidazoles basés sur des calix[6]arènes permettent d’obtenir des modèles supramoléculaires de site actif de métallo-enzymes (hydrolases à zinc, oxydases à cuivre). La structure du ligand contrôle non seulement la 1ère mais aussi la 2ème sphère de coordination du métal, ainsi que le chemin d’accès au centre métallique par des ligands exogènes L.6

Désirant moduler les caractéristiques physico-chimiques de la cavité hydrophobe afin d’évaluer son impact sur les propriétés de l’ion métallique coordiné vis-à-vis d’une molécule invitée (L), nous avons introduit, à l’entrée de cette dernière, au niveau du grand col du calix[6]arène, 3 groupements azotés supplémentaires7 (R = NH2) en place des 3 groupements tBu initialement présents.

  • L’étude du calix-ligand ainsi modifié a mis en évidence 4 points fondamentaux :

  • L’obtention d’un récepteur hydrophobe soluble en milieu aqueux

  • Une cavité agrandie pouvant accueillir des invités plus volumineux

  • La discrimination topologique des substrats par interaction avec 3 sites de reconnaissances

La possibilité de coordiner un second centre métallique à distance contrôlée du premier (6 Å), à l’image de sites actifs binucléaires de certaines métallo-enzymes (figure 1).8



Figure 1 : Système modèle entonnoir polytopique.

^ Vers l'élaboration de nouveaux biocatalyseurs d'oxydation sélective

Raffy, Q.; Ricoux, R.; Pethe S. et Mahy, J.-P.

Laboratoire de Chimie Bioorganique et Bioinorganique (LCBB) CNRS-UMR 8124,
Institut de Chimie Moléculaire et des Matériaux d’Orsay (ICMMO)Bâtiment 420, Université Paris-Sud, 91405 Orsay

qraffy@icmo.u-psud.fr


La construction de métalloenzymes artificielles est en plein essor, du fait de leursremarquables activité et sélectivité en milieu aqueux.La stratégie que nous développons pour élaborer des catalyseurs demonooxygénation sélective consiste à associer une métalloporphyrine, responsable del'activité, à un Fab (Fragment antigen-binding) d'anticorps anti-stéroïde, dont la cavitéprotéique sera chargée d'induire une sélectivité. Deux voies sont explorées.

La première consiste à obtenir un biocatalyseur anti-substrat en couplant covalemment uncofacteur métalloporphyrinique hydrosoluble à proximité du paratope du Fab, lequelpermettra une reconnaissance du substrat et devrait orienter la stéréosélectivité de laréaction d'oxydation. Pour parvenir à cette fixation à proximité du paratope, nous avonssynthétisé une porphyrine munie de deux « bras », dont l'un se termine par une testostéronemodifiée, et l'autre par une fonction acide carboxylique (Figure 1). Après méthylation desgroupements pyridiles et métallation de la porphyrine, le cofacteur obtenu sera incubé avecle Fab, la testostérone devant permettre le positionnement à proximité du paratope, tandisque le second bras permettra le couplage covalent.





La seconde stratégie consiste à utiliser la forte affinité de l'anticorps pour sonantigène pour fixer le cofacteur métalloporphyrinique dans le paratope du Fab. Ainsi, nousavons couplé la Tris-(p-pyridyl),mono-(p-aminophényl) porphyrine à l'oestradiol (Figure2). L'insertion de l'oestradiol dans le site de reconnaissance permettra un ancrage ducofacteur, obtenu après méthylation et métallation, dans le paratope du Fab.L'activité et la sélectivité des biocatalyseurs obtenus sera ensuite étudiée.

^ Greffage séquentiel de complexes de ruthénium sur silice mésoporeuse mésostructurée

S.Calmettes, B.Albela, O.Hamelin, S.Ménage, L.Bonneviot

ENS Lyon, Laboratoire de Chimie, Groupe Matériaux Hybrides,
46 allée d'Italie 69364 Lyon cedex 7

stephanie.calmettes@ens-lyon.fr

Un des axes de recherche du groupe des Matériaux Hybrides du Laboratoire de Chimie de l'ENS Lyon consiste à développer des catalyseurs hétérogènes en s'inspirant des métalloenzymes. Le but est de greffer des complexes métalliques sur un support inorganique et de bien étudier l'interface, afin d'établir des relations structure-réactivité. Le choix du support s'est porté sur des silices poreuses mésostructurées, car elles présentent une grande surface spécifique et possèdent une grande stabilité mécanique et thermique. Ce projet s'inscrit au sein d'une collaboration avec le LCBCRB, du CEA de Grenoble. Le laboratoire grenoblois a en effet mis au point des catalyseurs de fer et de ruthénium inspirés des métalloenzymes et efficaces en catalyse homogène d'oxydation énantiosélective de sulfures, par action du peroxyde d'hydrogène1:

Le travail a porté sur la mise au point de stratégies de greffage de ce type de complexe dans les pores des silices mésostructurées, dans le but d'obtenir les catalyseurs sur support solide et de les caractériser soigneusement, puis d'étudier leur réactivité vis à vis de l'oxydation de sulfures. Cette étude a consisté tout d'abord à synthétiser la silice "as-made" de départ, puis à la fonctionnaliser. L'objectif est d'isoler les sites réactifs à la surface du matériau par l'agent silylant tetraméthylsilane TMS. Initialement, la surface est couverte au 2/3 par les molécules de tensioactif cétyltriméthylammonium (CTA+), du fait de la répulsion électrostatique entre les têtes cationiques. On peut par exemple chercher à obtenir au final une proportion d' 1/3 de tensioactif CTA+ pour 2/3 d'agent silylant TMS : en effet, les molécules de tensioactif jouent le rôle de "cache moléculaire", ce qui permettra l'incorporation de molécules actives, dans une étape ultérieure

Le matériau est ensuite fonctionnalisé de manière séquentielle : greffage de "l'ancre moléculaire" du futur complexe, le fragment (3-isocyanatopropyl)triéthoxysilane [1], fonctionnalisation de cette ancre par réaction avec l'amine primaire 4-aminométhylpyridine [2], puis enfin introduction du complexe de ruthénium à partir du cis-[Ru(dmp)2(Cl)2], "dmp" signifiant (2,9)diméthyl-1,10-phénantroline, par substitution d'un ligand chlore du complexe par la pyridine de l'ancre moléculaire [3] (cf. schéma ci contre).

L'ensemble de cette séquence peut-être schématisé ainsi :

On a ainsi introduit du ruthénium sur des silices de degré de fonctionnalisation plus ou moins élevé : silice "as-made" où le tensioactif a été totalement extrait, silice partiellement silylée et silice totalement silylée.

Tous les matériaux obtenus ont été caractérisés grâce aux techniques de diffraction de poudre aux rayons X, d'analyses élémentaires, d'analyse thermogravimétrique, de spectroscopie par résonance magnétique nucléaire solide du 29Si et du 13C, de spectroscopie IR, Raman et UV-Visible. L'étude de la réactivité des différents systèmes a été réalisée en testant l'oxydation du thioanisole par le peroxyde d'hydrogène, en présence de nos différents catalyseurs supportés, la réaction étant suivie par Gaz Chromatography. On a ainsi évalué l'activité catalytique (Turn Over Number TON du sulfoxyde et de la sulfone, sélectivité) de deux types de solides : l'un comportant le complexe Ru(dmp)2 Cl2 disposé dans une silice où le tensioactif avait été totalement extrait, et l'autre présentant un environnement plus complexe, avec présence de TMS et de bras moléculaire (cf. au dessus) lié au ruthénium. Ces deux types de solide présentent bien une activité catalytique, et les efforts se sont dirigés vers la caractérisation des espèces solides et liquides avant et après réaction.

1. M.Chavanot, S.Ménage, O.Hamelin, F.Chanay, J.Pécault, M.Fontecave, Inorg.Chem., 2003 ,42,4810

^ La mitochondrie : physiologie et maladies de la chaîne respiratoire.

Yves de Keyzer

Génétique et Epigénétique des Maladies Métaboliques, Neurosensorielles et du Développement, GH Necker - Enfants Malades,
149 Rue De Sevres 75743 Paris Cedex 15

dekeyser@necker.fr

Biogenèse du complexe nitrate réductase A: caractérisation et implication
du centre [4Fe-4S] de spin 3/2 dans la maturation du complexe
.

^ Pascal Lancianoa, Alexandra Vergnesb , Stéphane Grimaldia, Adrien Savoyanta,
Patrick Bertranda, Axel Magalonb, Bruno Guigliarellia

a Unité de Bioénergétique et Ingénierie des Protéines BIP-UPR9036 Université de Provence
b Laboratoire de Chimie Bactérienne LCB-UPR9043 IBSM-CNRS et Université de Provence
31 chemin Joseph Aiguier 13402 Marseille cedex 20, France

lanciano@ibsm.cnrs-mrs.fr


La nitrate réductase A d’Escherichia coli (NRA) est une molybdoenzyme membranaire trimérique (NarGHI) qui catalyse la réduction du nitrate en nitrite. Le transfert d’électrons dans ce complexe respiratoire, depuis les quinones membranaires vers l’ion nitrate, implique successivement deux hèmes de type b, cinq centres fer-soufre et le cofacteur à Molybdène (Moco). Le mode de coordination et les propriétés rédox de ces centres ont été identifiés grâce à la combinaison de la mutagenèse dirigée, de la potentiométrie rédox et des spectroscopies RPE et optique.1 Toutefois, jusqu’à la détermination de la structure tridimensionnelle de l’enzyme, le centre FeS0 situé dans la sous-unité catalytique NarG à proximité du Moco et possédant une coordination atypique His-(Cys)3, avait échappé à la détection. Par la suite, des raies de faible intensité observées autour de g = 5 et typiques d’un spin S=3/2 ont été associées à ce centre [4Fe-4S]1+, mais n’excluaient pas l’existence d’une hétérogénéité d’état de spin.2 Grâce à la caractérisation détaillée des propriétés magnétiques de ce centre et à la prise en compte des probabilités de transition dans la quantification du signal RPE, nous montrons qu’il est possible de mesurer précisément sa stœchiométrie. L’identification claire de la signature RPE associée au centre FeS0 permet ainsi d’aborder l’étude des interrelations entre ce centre et le Moco proche, dans le processus de maturation de l’enzyme. Nous montrons que l’insertion successive de ces cofacteurs est pilotée par une même protéine chaperonne. 3


1. Blasco, F., Guigliarelli, B. et al. 2001 Cell Mol Life Sci 58, 179-93.

2. Rothery, R. A., Bertero, M. G. et al. 2004 Biochemistry 43, 5324-33.

3. Lanciano, P.,Vergnes, A., et al Manuscrit en préparation

Biogenese du complexe nitrate réductase A: la protéine NarJ coordonne
l'assemblage et l'insertion des centres métalliques.


Vergnes, A.1; Lanciano, P. 2; Toci, R. 1; Pommier, J. 1; Grimaldi, S. 2; Guigliarelli, B. 2; Giordano, G. 1; et Magalon, A. 1

1Laboratoire de Chimie bactérienne, 2Laboratoire de Bioénergétique et Ingénierie des Protéines, Institut de Biologie Structurale et de Microbiologie, CNRS
31, chemin Joseph Aiguier 13402 Marseille cedex 20

vergnes@ibsm.cnrs-mrs.fr


La dynamique d’assemblage de complexes respiratoires à plusieurs centres métalliques est finement contrôlée pour assurer la synthèse de complexes actifs. Le complexe respiratoire membranaire modèle, la nitrate réductase A chez Escherichia coli, est un hétérotrimère (NarGHI) composé d’une sous-unité catalytique NarG contenant un centre [Fe-S] et le cofacteur à molybdène, d’une sous-unité de transfert d’électrons comprenant quatre centres [Fe-S] et d’une sous-unité d’ancrage NarI ayant deux hèmes de type b1.

L’utilisation d’une approche pluridisciplinaire alliant la biologie moléculaire, la biochimie et la spectroscopie RPE nous a permis de montrer que la protéine NarJ -indispensable à l’activité enzymatique du complexe- coordonne l’insertion de plusieurs centres métalliques à l’assemblage du complexe multimérique3-4. Les relations que la protéine NarJ a avec diverses machineries de biosynthèse (cofacteur à molybdène et [Fe-S]) sont analysées dans le contexte de la biogenèse et de la dynamique d’assemblage de complexes respiratoires à plusieurs centres métalliques qu’ils soient ou non transloqués à travers la membrane cytoplasmique via la machinerie Tat5.


1. Blasco, F.; Guigliarelli, B.; Magalon, A.; Asso, M.; Giordano, G.; Rothery, R.A. Cell Mol Life Sci 2001, 58, 179-93.

2. Bertero, M.G.; Rothery, R.A.; Palak, M.; Hou, C.; Lim, D.; Blasco, F.; Weiner, J.H.; Strynadka, N.C. Nat Struct Biol 2003, 10, 681-7.

3. Vergnes, A.; Gouffi-Belhabich, K. ; Blasco, F. ; Giordano, G. ; Magalon, A. J Biol Chem 2004, 279, 41398-403.

4. Vergnes, A. ; Pommier, J. ; Toci, R. ; Blasco, F. ; Giordano, G. ; Magalon, A. J Biol Chem 2006.281, 2170-6.

5. Palmer, T. ; Sargent, F. ; Berks, B.C. Trends Microbiol. 2005, 13, 175-80.

Que faire de biomimétique avec : 1) des complexes dichloroferreux à ligands aminométhyl pyridine et 2) du dioxygène ? Rôle de l’acidité de Lewis du métal dans la coordination de O2, et transformation catalytique du cyclohexane en cyclohexanone.

Thallaj, N. K.; Benhamou, L.; Przybilla, J.; Lachkar, M. ; Mandon, D.

Laboratoire de Chimie Biomimétique des Métaux de Transition
Institut de Chimie LC n° 3 UMR CNRS 7177
Université Louis Pasteur Strasbourg, France

mandon@chimie.u-strasbg.fr


Il existe à l’heure actuelle une profusion d’articles traitant de la chimie biomimétique du fer et du manganèse dans des complexes à ligands aminométhylpyridine de type TPA [tris(2-pyridylmethyl)amine] ou autre1,2. Il existe toutefois beaucoup moins d’études qui décrivent la réactivité de tels complexes en présence de dioxygène3.

Pour notre part, nous communiquons régulièrement au ^ Club Métalloprotéines et Modèles des résultats obtenus au laboratoire en absence de substrats. Nous avons maintenant une expérience qui s ‘étale sur une vingtaine de complexes de géométrie et propriétés électroniques variées. L’objet de cette présentation est de montrer comment on réussit à moduler la réactivité d’un centre métallique simple en jouant sur les propriétés électroniques des ligands ainsi que sur la géométrie au centre métallique, et ce en série TPA. Nous travaillons en absence de substrats, ou en présence de cyclohexane. Dans ce dernier cas, nous pouvons parfois transformer très proprement le cyclohexane en cyclohexanone, et ce de façon catalytique.

Nous pensons qu’à l’instar de ce qui est postulé en chimie des métallobiomolécules, la coordination du dioxygène au métal est un élément crucial, c’est à dire que le métal joue un rôle différent que celui de simple activateur de radicaux dans des processus radicalaire de type Haber-Weiss par exemple. Nous discuterons pourquoi.


1. Costas, M. ; Chen, K. ; Que, L. Jr. Coord. Chem. Rev., 2000, 200 – 202, 517 - 544

2. Costas, M. ; Mehn, M. P. ; Jensen, M. P.; Que, L. Jr. Chem. Rev. 2004, 104, 939 – 986

3. voir par exemple avec des ligands à motifs aminométhylpyridine les articles suivants : Raffard, N., Balland, V., Simaan, J., Letard, S., Nierlich, M;, Miki, K., Banse, F., Anxolabehere-Mallart, E., Girerd, J. J., C. R. Chimie, 2002, 5, 99-109. Raffard-Pons Y Moll, N., Banse, F., Miki, K., Nierlich, M., Girerd, J.-J., Eur. J. Inorg. Chem., 2002, 1941-1944.


Synthèse et Caractérisations Spectroscopiques de Nouveaux Complexes de Fe(II) Précurseurs de Modèles d’Intermédiaires Enzymatiques.

Martinho, M.; Banse, F.; Sainton, J.; Philouze, C.; Guillot, R.; Blain, G.;
Dorlet, P.; Lecomte, S. and Girerd, J-J.

Université Paris-XI, Laboratoire de Chimie Inorganique
ICMMO, UMR 8182, Equipe de Chimie Inorganique, bât. 420,
Univ. Paris-XI, 91405 Orsay cedex

martinho@icmo.u-psud.fr


Les espèces Fe(III)-OOH mononucléaires non-hémiques sont très souvent évoquées comme étant des intermédiaires clés dans les cycles catalytiques des systèmes biologiques (métallo enzymes) impliqués dans l’activation du dioxygène.[1,2] La modélisation des sites actifs de ces métallo enzymes a pour but la synthèse de catalyseurs d’oxydation biomimétiques efficaces et non polluants. Des espèces Fe(III)-OOH non porphyriniques ont déjà été identifiées. Leur capacité à oxyder de petites molécules organiques est encore une source de débat dans la communauté scientifique.[3,4]

Ce travail présente la synthèse et la caractérisation de nouveaux complexes de Fe(II) obtenus avec un nouveau ligand L52aH, qui porte une fonction pivaloylamido. La réaction de ces complexes de Fe(II) en présence de H2O2 a permis l’obtention d’un intermédiaire Fe(III)-OOH. La réaction entre les complexes de Fe(II) et le dioxygène a également été étudiée.






L52aH



[(L52a)FeII]+



[(L52aH)FeII]2+



^ Complexes de MnII et MnIII à ligand pentadente. Réactivité avec H2O2.
Vers des complexes peroxo et hydroproxo


Groni S.; Blain, G.; Guillot, R.; Bourcier, S.; Dorlet, P. ; Anxolabéhère-Mallart, E.

Université Paris-Sud
Equipe de Chimie Inorganique-UMR 8182
Bât : 420, Orsay 91405

sigroni@icmo.u-psud.fr

La photosynthèse est un processus complexe de conversion de l’énergie solaire en énergie chimique. La compréhension de ce processus est un des défis actuels des biochimistes et chimistes bioinorganiciens. De récents travaux1 ont amélioré la connaissance de la structure du site rationnel du CDO « Centre de Dégagement du diOxygène », qui est constitué d’un cluster de Mn4Ca. De nombreux mécanismes d’oxydation de l’eau ont été proposés. Il a été proposé que la réactivité catalytique du CDO ait principalement lieu au niveau d’un ion Mn terminal. En particulier, des espèces mononucléaires très réactives de type MnIV=O ou MnV≡O pourraient intervenir dans le mécanisme de formation de la liaison O-O ainsi qu’un intermédiaire Mn-peroxo.2,3







Fig 1 : Ligand mL52

Fig 2 :Complexe [(mL52)MnII(Cl)]2+

Fig.3 : Complexe [(mL52)MnII(OH2)]2+


Il est important de développer de nouvelles méthodes de préparation de ces espèces et de les caractériser. Les travaux présentés décrivent la synthèse de nouveaux complexes de MnII obtenus avec le ligand mL52 (Fig. 1) possédant une position libre dans la sphère de coordination. Plusieurs complexes de MnII ont été obtenus (Fig. 2 et Fig.3). La caractérisation de ces complexes par spectroscopies UV-visible, RPE, cyclique et spectrométrie de masse ESI-MS est présentée. L’addition d’oxydant donneur d’oxygène tel que H2O2 et KO2 est étudiée. La formation d’espèces mononucléaires de MnIII-peroxo et MnIII-hydroperoxo est mise en évidence par spectroscopie RPE en mode parallèle.


1. K. N. Ferreira, T. M. Iverson, K. Maghlaoui, J. Barber, S. Iwata, Science, 2004, 303, 1831-1838

2. Pecoraro, V. L.; Hsieh, W.-Y., In Metal in Biological Systems; Sigel, A., Sigel, H., Eds.; M. Dekker, 2000, 37,

429-504

3. Vrettos, J. S. W.; Philos, Trans. R. Soc. London, Ser. B, 2002,357, 1395-1404

Complexes de Cu(II)-ACC: préparation et réactivité de type “ACC-Oxydase” en présence d’eau oxygénée. Caractérisation d’un intermédiaire réactionnel.

Ghattas, W.; Gaudin, C.; Giorgi, M.; Hitomi, Y.; Simaan. J.; Réglier, M.

Université Paul Cézanne
Biosciences FRE CNRS 3005
Faculté des Sciences et Techniques, Saint Jérôme
13397 Marseille Cedex 20

wadih_ghattas@yahoo.com


L’éthylène est une hormone qui régule plusieurs étapes de la vie d’une plante, comme la germination la maturation des fruits, la chute des feuilles... La dernière étape de la biosynthèse de l’éthylène est catalysée par l’ACC-Oxydase, une enzyme à fer non hémique qui utilise l’oxygène pour oxyder l’1-aminocyclopropane carboxylique acide (ACC) en éthylène (Figure 1).





Figure 1: Oxydation de l’ACC en éthylène par l’ACCO.


De nombreuses questions demeurent sur le mécanisme d’action de l’ACCO et le rôle de l’ion métallique. Il est cependant admis que la première étape de la réaction consiste en la fixation de l’ACC et du dioxygène sur l’ion Fe(II).

Nous nous sommes donc intéressés à étudier la coordination de l’ACC sur un ion métallique afin d’obtenir des données structurales et d’en étudier la réactivité. Les résultats présentés ici concernent l’étude de complexes Cu(II)-ACC, plus particulièrement, le complexe [(Bipy)Cu(ACC)(H2O)].ClO4 qui a été préparé et caractérisé à l’état solide (Figure 2) ainsi qu’en solution.




Figure 2: . structure RX du [(Bipy)Cu(ACC)(H2O)].ClO4

La réactivité de ce complexe avec l’eau oxygénée permet de générer de l’éthylène. Au cours de cette réaction un intermédiaire a été observé et caractérisé à basse température. L’utilisation d’un analogue de l’ACC (AIB) non réactif a permis de stabiliser l’intermédiaire et d’en faciliter la caractérisation.

^ Enantioselective Oxidation

A New Non-Heme Iron Complex in Olefins Epoxidation

Marchi Delapierre, C. ; Jorge, A. ; Fontecave, M. and Menage, S.

Laboratoire de Chimie et Biochimie des Centres Redox Biologiques, UMR5047, DRDC-CB, CEA-Grenoble, 17 rue des Martyrs, 38000 Grenoble, France

caroline.marchi-delapierre@cea.fr


The aim of this work is the study of new non-heme iron complexes as enantioselective catalysts in accord with the environmentally claims. Indeed, iron is a cheap and a non-toxic metal underused in asymmetric epoxidation.1

We decided to study the properties of a binuclear complex, bioinspired on diiron oxo-proteins, obtained by complexation of iron(III) perchlorate with a modified chiral bipyridyl ligand.2,3



The results obtained in enantioselective epoxidation of trans--methylstyrene are the first examples using this type of catalyst in asymmetric epoxidation with a very high efficiency (up to 900 turnover number), even if enantiomeric excesses still are modest (20 to 30%).



More over, first results in application of this catalyst to the oxidation of less activated olefins showed a notable enhancement of the enantioselectivity.

The control of selectivity and the mechanistic pathway will be discussed.


1. Stack, T.D.P. et coll. Org. Lett. 2003, 5, 2469.

2. Lipscomb, J.D. et coll. Chem. Rev. 1996, 96, 2625.

3. Fletcher N.C. et coll. Helv. Chim. Acta 1996, 79, 1192-1202.

Neuroglobine : structure-fonction

Michael Marden

Pathologie de la Polymerisation des Proteines, Substitut du Sang,
et Maladies Rares du Globule Rouge,
Chu de Bicetre
78 Rue du General Leclerc, Batiment Paul Broca
94275 Le Kremlin Bicetre Cedex

marden@kb.inserm.fr

Surexpression hétérologue d’une hydrogénase à fer d’algue verte chez la bactérie anaérobie facultative ^ Shewanella oneidensis

Antoine, T a; Fourmont, V a; Rousset, M b; Méjean, V c ; Bottin, H a

a Sce Bioénergétique, DBJC, CEA de Saclay 91191 Gif-sur-Yvette cedex
b CNRS, BIP. 31 chemin Joseph Aiguier. 13402 Cedex 20 Marseille.
c CNRS, LCB. 31 chemin Joseph Aiguier. 13402 Cedex 20 Marseille.

tatiana.antoine-pierret@cea.fr


Les hydrogénases sont des enzymes qui catalysent la réaction réversible H2 ↔ 2H+ +2e-. L’hydrogénase à fer de ^ Chlamydomonas reinhardtii HydA1 ne possède pas de domaine 2[4Fe-4S] de transfert d’électron et est réduite directement par une ferrédoxine [2Fe-2S]. La maturation de HydA1 nécessite deux protéines : HydEF et HydG. L’étude du taux de codons rares de HydA1 chez des organismes qui ont des homologues putatifs de HydA1, HydEF et hydG a donné le meilleur résultat chez Shewanella oneidensis. Une étude récente du transcriptome de Shewanella oneidensis a montré que le gène de l’hydrogénase à fer putative est surexprimé en conditions réductrices du thiosulfate (1). La souche Shewanella oneidensis A1, qui surexprime le gène hydA1 (2), a été cultivée en anaérobiose avec du thiosulfate comme accepteur d’électron. Elle a synthétisé la protéine HydA1 active (1,5 mg l-1 de culture après purification). Les études biophysiques du transfert d’électron photosystèmeI- Fd- hydrogènase (spectroscopie d’absorption par éclair, électrochimie) sont en cours.


1. Beliaev AS, Klingeman DM, Klappenbach JA, Wu L, Romine MF, Tiedje JM, Nealson KH, Fredrickson JK, Zhou J. ^ J Bacteriol. 2005 Oct;187(20):7138-45

2. Asamizu E, Nakamura Y, Sato S, Fukuzawa H, Tabata S, DNA Research 1999; 6, 369-373

NikR un régulateur transcriptionnel chez Helicobacter pylori et

Escherichia coli : Effet du Ni(II) et du pH

aFauquant, C., aDiederix, R.E.M., bRodrigue, A., cDian, C., cKapp, U., cTerradot, L., bMandrand-Berthelot, M.A., and aMichaud-Soret, I.

a Laboratoire de Physico-chimie des Métaux en Biologie (UMR 5155 CEA-CNRS-UJF), CEA-Grenoble, 17 avenue des Martyrs, 38054 Grenoble cedex 9, France.
b Unité de Microbiologie et Génétique (UMR 5122 CNRS-UCB-INSA), Université Lyon1, 10 rue Raphael Dubois, 69622 Villeurbanne cedex, France.
c The European Synchrotron Radiation Facility, BP 220, F-38043 Grenoble Cedex 9 France.

caroline.fauquant@cea.fr


Helicobacter pylori est une bactérie pathogène responsable des nombreuses maladies gastriques chez l’homme. Bien que neutrophile, elle est néanmoins capable de se développer dans un environnement soumis à des stress acides grâce à son enzyme à Ni(II), l’uréase. Pour ce microorganisme, le Ni(II) est donc un métal essentiel dont la concentration doit être strictement contrôlée. Ce contrôle est permis par le facteur de transcription NikR [1, 3] qui régule l’expression de l’uréase chez H.pylori et de Fe-Ni hydrogenase chez E.coli ainsi que des transporteurs du Ni(II), NixA et NikABCDE.

NikR d’H.pylori (HpNikR) versus NikR d’E.coli (EcNikR) est un régulateur global capable non seulement de réprimer (NixA) mais aussi d’induire (UreA) la transcription de gènes en fonction de la concentration en Ni(II) [1, 2, 3, 5]. L’effet du Ni(II) mais aussi du pH ont été étudiés sur HpNikR et EcNikR par spectroscopie d’absorption UV-Vis, par gel filtration et par filter binding et ils diffèrent notablement. EcNikR est plus sensible à l’agrégation Ni(II)-dépendante que HpNikR. Ce comportement est réversible par ajout d’EDTA. L’absence d’un cluster d’histidines présent à l’embouchure du site de haute affinité chez HpNikR semble être responsable de cette différence [4]. L’effet du Ni(II) sur la liaison d’HpNikR sur l’ADN a aussi été étudié par anisotropie de fluorescence et des expériences de retard sur gels. La liaison sur les régions promotrices de gènes induits [2] ou réprimés [5] a été comparée.


1. van Vliet, A.H., Ernst, F.D., and Kusters, J.G. Trends Microbiol, 2004. 12, p. 489-94.

2. Abraham, L.O., Li, Y., and Zamble, D.B. J Inorg Biochem, 2006. 100, p. 1005-14.

3. Dosanjh, N.S. and Michel, S.L. Curr Opin Chem Biol, 2006. 10, p. 123-30.

4. Fauquant, C., Diederix, R.E.M., Rodrigue, A., Dian, C., Kapp, U., Terradot, L., Mandrand-Berthelot,

M.A., and Michaud-Soret, I. Biochimie, 2006. in press

5. Wolfram, L., Haas, E., and Bauerfeind, P., J Bacteriol, 2006. 188, p. 1245-50.


Les NO Synthases de Staphylococcus aureus et Bacillus anthracis : Interactions avec les analogues de L-arginine et des ligands du fer

Salard, Ia; Boucher, J-La; Nioche, Pb; Martasek Pc; Raman, C.Sb; and Mansuy, Da.

a : Université Paris 5 René Descartes, Laboratoire de Chimie et Biochimie Pharmacologiques et Toxicologiques UMR 8601, 45 rue des Saints-Pères, 75270 Paris Cedex 06
b : University of Texas Medical School, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Houston, TX 77030, USA
c : First School of Medicine, Charles University, Department of Pediatrics, 12109 Prague, Czech Republic.

isabelle.salard@etu.univ-paris5.fr


Chez les mammifères, le monoxyde d’azote NO est produit par des enzymes appelées NO Synthases (NOS) qui catalysent l’oxydation de la L-arginine en L-citrulline et NO avec formation d’un intermédiaire : la N-hydroxy-L-arginine. Ces protéines sont constituées de deux domaines : un domaine oxygénase qui lie l’hème, le substrat et un cofacteur la tétrahydrobioptérine (BH4) d’une part ; et un domaine réductase d’autre part qui transfère les électrons du NADPH aux flavines FAD et FMN puis à l’hème.

Récemment, le séquençage de nombreux génomes bactériens a permis de mettre en évidence des gènes codant pour des protéines homologues au domaine oxygénase des NOS de mammifères. Ces protéines sont appelées « NOS de bactéries », mais leurs rôles exacts au sein de ces micro-organismes reste encore à déterminer.

Les interactions entre des analogues de L-arginine, des ligands du fer et les NO synthases de ^ Staphylococcus aureus (saNOS) et Bacillus anthracis (baNOS) ont été étudiées par spectroscopie UV-visible et RPE. A l’état natif, en présence d’analogues de L-arginine ou d’autres ligands, les saNOS et baNOS présentent des caractéristiques très similaires à celles décrites pour d’autres hème-thiolate protéines telles que les NOS de mammifères et les cytochromes P450. Nous avons cependant observé des différences importantes entre ces deux protéines : à l’état natif, saNOS est majoritairement sous sa forme FeIII bas spin hexacoordiné tandis que baNOS est majortitairement FeIII haut spin pentacoordiné ; la présence de BH4 ou de ses analogues augmente l’affinité de saNOS pour la L-arginine, phénomène qui n’est pas observé pour baNOS et, enfin, à l’état FeII et contrairement à baNOS, saNOS peut lier des ligands encombrés tels que des nitrosoalcanes et le tert-butylisonitrile.

^ Toxicité du Cobalt (II) et localisation intra-cellulaire par ICP-AES dans la lignée cellulaire de kératinocytes HaCaT

Sandre, C. 1; Gault, N. 2; Poncy, JL. 2; Lefaix, JL. 2; Bresson, C. 1; Lamouroux, C. 1; Tabarant, M. 3; and Moulin, C. 1

1,3 CEA Saclay DEN / DANS / DPC / SECR / LSRM and LRSI – 91191 Gif sur Yvette
2 CEA Fontenay aux Roses DSV / DRR - 92265 Fontenay-aux-Roses

caroline.sandre@cea.fr


C’est en raison des risques d’exposition professionnelle au cobalt dans l’industrie nucléaire,notamment par voie cutanée, que sont étudiées la toxicité du cobalt et sa distribution intracellulaire dans des cellules constituant l’épiderme, les kératinocytes humains HaCaT. Dans un premier temps, des études in vitro de cytotoxicité et génotoxicité chimiques du cobalt soluble ont été menées par différents tests biologiques et le test des « comètes » a été ensuite utilisé pour analyser la toxicité radiologique. Puis, l’accumulation et la distribution intra-cellulaire du cobalt ont été déterminées grâce à un protocole de fractionnement sub-cellulaire par centrifugation différentielle adaptée aux contraintes des techniques analytiques. Enfin, des analyses par techniques couplées (SEC/ICP-AES) dans la fraction cytosolique sont en cours pour déterminer les métalloprotéines liant le cobalt.




Chromatogrammes obtenus par couplage (a) SEC/UV (280 nm) et (b) SEC/ICP-AES (228.616 nm) de fractions cytosoliques de cellules HaCaT après 48 h de contamination avec 400 µM Co (II)

^ Etude Structurale de la protéine PerR par diffraction des rayons X

Daouda A. K. Traore1,2, Abdelnasser El Ghazouani1, Sougandi Ilango1,
Jérôme Dupuy2, Lilian Jacquamet2, Jean-Luc Ferrer2,
Christelle Caux-Thang1, Victor Duarte1 Et Jean-Marc Latour1

1. DRDC / PMB, UMR 5155 CEA-CNRS-UJF,CEA Grenoble 17 Avenue des Martyrs,
38054 Grenoble Cedex 9, France
2. LCCP - Groupe Synchrotron / IBS, UMR 5075 CEA-CNRS-UJF, 41 rue Jules Horowitz, 38027 Grenoble Cedex 1, France

daouda.traore@ibs.fr


L'oxygène est à la fois indispensable et dangereux pour les êtres vivant qui l'utilisent, qu'ils soient d'origine eucaryote ou procaryote. L'oxygène moléculaire est pleinement réduit en molécule d'eau par les organismes qui respirent. Au cours de ce processus, diverses espèces partiellement réduites et réactives de l'oxygène (ROS) telles que OH° et H2O2 sont formées. Ces espèces sont très nocives pour les cellules. En conditions de stress oxydant il existe des systèmes de détoxication qui reposent essentiellement sur l'expression d'enzymes capable de dégrader les ROS. De façon générale, l'expression de ces enzymes est sous contrôle d'un régulateur.

Chez Bacillus Subtilis, la protéine PerR, activée spécifiquement par H2O2 est le régulateur transcriptionnel des gènes impliqués dans la résistance à H2O2. Cette métalloprotéine contient deux sites: un site à Zn structural et un site de régulation ayant une forte affinité pour le Fe2+ ou le Mn2+. En présence de H2O2 la réaction localisée sur le métal de régulation conduit à l'oxydation de deux ligands histidine du métal. Cette oxydation entraîne la levée de répression et permet ainsi l'expression des protéines impliquées dans la dégradation des ROS. Les résultats présentés montrent la structure tridimensionnelle de la protéine PerR-Zn obtenue par diffraction des rayons X. Cette structure indique que le zinc est coordonné par les 4 cystéines de la protéine et que ce site se révèle indispensable au maintien de la structure dimérique de la protéine. Des alignements de séquences et des études de modélisation moléculaire nous ont permis d'obtenir un modèle de la forme active de la protéine. Ce modèle présente un site potentiel de fixation pour le métal de régulation et nous permet de proposer un mode d’interaction ADN-protéine.

^ Production, purification et caractérisation moléculaire d’une quercétinase

chez Penicillium olsonii

Tranchimand, S; Gaydou, V; Ertel, G; Tron, T; Gaudin, C; et Iacazio, G.

Université Paul Cézanne
Laboratoire de Bioinorganique Structurale
Avenue escadrille Normandie-Niemen, 13397 Marseille CEDEX 20

s.tranchimand@univ-cezanne.fr


Les quercétinases sont des dioxygenases appartenant à la voie catabolique de la rutine, produites par différents champignons filamenteux, quand ceux-ci sont cultivés sur rutine comme unique source de carbone et d’énergie. Les quercétinases catalysent la décompositionde la quercétine en depside avec libération concommitente de monoxyde de carbone (Figure 1). Elles appartiennent à la superfamille des cupines, famille très diverse de métalloprotéines contenant différents métaux (Fe, Cu, Zn, Mn, Ni, Co).

Notre étude a porté sur une quercétinase produite par le champignon filamenteux ^ Penicillium olsonii. Nous avons étudiés dans un premier temps l’effet de certains composés phénoliques et de certains sucres, appartenant à la voie catabolique de la rutine, sur l’induction de l’activité quercétinase chez ce champignon1,2. Nous avons ensuite purifié l’enzyme et caractérisé celle-ci. Certains paramètres physico-chimiques et cinétiques de cette enzyme ont été déterminés. Enfin, une étude de PCR dégénérée sur l’ADN génomique suivie de l’utilisation des technologies SMART® et RACE® à partir des ARNm, nous a permis d’identifier le cadre ouvert de lecture codant pour la quercétinase. La connaissance de cette séquence nous a permis d’en effectuer l’expression hétérologue chez Saccharomyces cerevisiae en utilisant la technologie de clonage Gateway®.




Figure 1: Réaction catalysée par la quercétinase


1. Tranchimand, S.; Tron, T.; Gaudin, C.; Iacazio, G. FEMS Microbiology Letters, 2005, 253, 289-294

2. Tranchimand, S.; Tron, T.; Gaudin, C.; Iacazio, G. Synthetic Commun., 2006, 36, 587-597

Dinucleotide spore photoproduct: a minimal substrate of the DNA REPAIR Spore Photoproduct Lyase enzyme from Bacillus subtiliS.

Alexia Chandor, Olivier Berteau, Thierry Douki, Didier Gasparutto, Yannis Sanakis, Sandrine Ollagnier-de-Choudens, ^ Mohamed Atta, and Marc Fontecave.

Laboratoire de Chimie et Biochimie des Centres Rédox Biologiques, DRDC-CB, UMR 5047 Commissariat à l’Energie Atomique (CEA) / CNRS / Université Joseph Fourier (UJF), 17 Rue des Martyrs 38054 Grenoble Cedex 09.

mohamed.atta@cea.fr


The overwhelming majority of DNA photoproducts in UV–irradiated spores is a unique thymine dimer called Spore Photoproduct (SP, 5-thymine-5,6-dihydrothymine). This lesion is repaired by the Spore Photoproduct Lyase (SP Lyase) enzyme that directly reverts SP to two unmodified thymines. The SP Lyase is an S-adenosylmethionine (SAM)-dependent iron-sulfur protein that belongs to the Radical-SAM superfamily. In the present work, using a well-characterized preparation of the SP Lyase enzyme from Bacillus subtilis, we show that SP in the form of a dinucleoside monophosphate (SPTpT) is efficiently repaired, allowing a kinetic characterization of the enzyme. The preparation of this new substrate is described and its identity confirmed by mass spectrometry and comparison with authentic spore photoproduct. The fact that SPTpT dimer is repaired by SP Lyase may indicate that the SP lesion does not absolutely need to be contained within a single- or double- stranded DNA for recognition and repaired by the SP Lyase enzyme.



1. Beinert, H., Holm, R. H. & Munck, E. Iron-sulfur clusters: nature's modular, multipurpose structures. Science 277, 653-9 (1997).

2 . Johnson, D. C., Dean, D. R., Smith, A. D. & Johnson, M. K. Structure, function, and formation of biological iron-sulfur clusters. ^ Annu Rev Biochem 74, 247-81 (2005).

3. Barras, F., Loiseau, L. & Py, B. How Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae build Fe/S proteins. Adv Microb Physiol 50, 41-101 (2005).

4 Fontecave, M., Choudens, S. O., Py, B. & Barras, F. Mechanisms of iron-sulfur cluster assembly: the SUF machinery. J Biol Inorg Chem, 1-9 (2005).

5 Tjandra, N., Omichinski, J. G., Gronenborn, A. M., Clore, G. M. & Bax, A. Use of dipolar H-1-N-15 and H-1-C-13 couplings in the structure determination of magnetically oriented macromolecules in solution. Nature Structural Biology 4, 732-738 (1997).

6 O. Sénèque, M.-N. Rager, M. Giorgi, and O. Reinaud, J. Am. Chem. Soc. 122, 6183-6189 (2000) ; O. Sénèque, M.-N. Rager, M. Giorgi, and O. Reinaud, J. Am. Chem. Soc. 123, 8442-8443 (2001).

7 S. Redon, Y. Li, O. Reinaud, J. Org. Chem. 2003, 68, 7004-7008.

8 D. Coquière, J. Marrot, O. Reinaud, Chem. Com. 2006, ASAP.




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